1 1 1 1 1 Рейтинг 0.00 (0 Голосов)

Легкомысленно пообещав (почти все обещания несут оттенок легкомыслия) написать отзыв о новой книге на тему, которую я в этом журнале в шутку называю геккелизмом, я вынужден хотя бы частично это обещание исполнить. Для понимания моего отношения к геккелизму, т.е. к попытками научного анализа проблемы возникновения жизни, которые неизменно приводят к тем же ответам, которыми уже поделился с публикой знаменитый естествоиспытатель 19 века Э. Геккель, известный всем открытием монер (написано правильно, не мАнер, а мОнер*), предлагаю пробежать некоторые мои заметки на эту тему: тюк (это ссылка на первую часть из пяти, можно найти все, нажимая на "продолжение следует" в конце каждой части), тюктюктюк, разгорелся наш утюг.

Книга, о которой идет речь - “Происхождение жизни. От туманности до клетки”, написанная М. Никитиным. Забегая вперед, скажу, что книга в целом неплохо рассказывает читателю о состоянии исследований в этой области. В ней более откровенно, чем во многих подобных работах, говорится о существующих проблемах, хотя каждый из таких рассказов все равно завершается извлечением белого кролика из помятой шляпы геккелиста. Но это тоже понятно – иначе нельзя рассказать широкой публике об исследованиях происхождения жизни естественным путем, если желаешь оставаться на правильной стороне истории и прогресса.

Обложка книги
Обложка.jpg


К недостаткам книги следует отнести то, что ссылки на научные работы, о которых идет речь, даются не всегда. Это в принципе допустимо для популярной книги, но делает крайне неудобным проверку утверждений автора. Поэтому создается впечатление (и, возможно, верное), что такой подход выбран сознательно.

Паки забегая вперед, скажу, что на примере нескольких критических глав я постараюсь показать, что (а) извлеченный из шляпы кролик оказывается не решением проблемы, как это объявляется, а обычной иллюзией, используемой фокусниками, и (б) многие утверждения, якобы описывающие экспериментальные факты, не являются истинными. Два эти обстоятельства делают большую часть выводов автора несостоятельными.

Белый кролик из шляпы. А истинный ли это кролик!
rabbit-out-of-a-hat.jpg


По ходу этой заметки я иногда буду довольно много пересказывать. Хотя пересказ нередко бывает скучен, без этого невозможно высказывать несогласие с точкой зрения автора. Поэтому прошу вас набераться терпения.

Итак, структура книги вполне соответствует классической схеме книг подобного рода, что в целом положительно. Первые главы книги посвящены Солнечной системе, ее происхождению, геологии планет земной группы, а также эволюции и современному состоянию их атмосфер. Действительно, эти вопросы имеют прямое отношение к обсуждаемой проблеме.

Из интересного в этих главах стоит отметить рассказ о возрасте Земли и первых геологических свидетельствах жизни (графит со смещенным изотопным составом, полосчатые отложения железа), в главе 3, посвященной геологии планет земной группы. Возраст первых следов жизни датируется 4,3-3,8 млрд лет назад. Возраст древнейших зерн циркона (т.е. древнейших твердых тел на Земле) принимается равным 4,1-4,4 млрд лет, фрагментов континентальной коры – 4 млрд лет, осадочных пород – 3,8 млрд лет. Соотношение изотопов кислорода используется как аргумент о наличии воды 4,4 млрд лет назад. Из этих дат можно сделать вывод, что жизнь на Земле возникает практически одновременно с появлением земной коры и жидкой воды.

На это обстоятельство стоит обратить внимание, поскольку такое стремительное по геологическим масштабам возникновение жизни на Земле, с одной стороны, поддерживает идеи неизбежности возникновения жизни, а с другой не оставляет времени для того огромного числа бросков «молекулярных костей», о котором так часто говорят геккелисты.

В главе 5 дается очерк истории идеи происхождения жизни, что тоже находится вполне в русле классических книг по этой проблеме. Кратко пересказываются пионерские идеи Опарина и Холдейна, дается даже обзор идей панспермии. Рассказывается о первых опытах Миллера и Юри по абиогенному синтезу органики и честно перечисляются нерешенные проблемы: отсутствие хиральности (оптической асимметрии) синтезированной органики, отличающее эти продукты от биологических молекул; отсутствие органических продуктов в опытах с углекислотной газовой смесью, реалистично моделирующей вулканическую атмосферу ранней Земли и т.д.

Глава 6 начинается с критики идеи возникновения жизни в «первичном бульоне», т.е. в гомогенном водном растворе. Главная из перечисленных проблем состоит в том, что биополимеры (белки, нуклеиновые кислоты) в воде преимущественно расщепляются на составные кирпичики в процессе с участием молекул воды (гидролиз), а отнюдь не синтезируются из этих кирпичиков. Для того, чтобы шел синтез, а не распад полимеров, требуется получить их активированные предшественники. В клетке для этого существует сложная ферментативная система, а в опытах по абиогенному синтезу, если они моделируют «первичный бульон», активированные аминокислоты и нуклеозиды (кирпичики белков и нуклеиновых кислот) не образуются.

В качестве решения проблемы автором предлагается синтез предшественников биомакромолекул в гетерогенных системах, в качестве каковых могут выступать либо минеральные поверхности (например, глина), либо предшествующие возникновению макромолекул липидные пузырьки, в целом похожие на мембраны ныне существующих клеток.

Все это является адекватным изложением существующих идей в области учения о происхождении жизни естественным путем. И именно поэтому следует всегда внимательно следить за руками фокусника. Не отвлекайтесь на отражения в зеркалах и клубы дыма, исходящие из магического фонаря.

Цитата: “Эксперименты показали, что запекание сухих смесей нуклеотидов при температуре 120°C приводит к образованию коротких цепочек РНК из 3–10 нуклеотидов. Для соединения аминокислот в белки эти условия слишком жесткие, они приводят к разложению самих аминокислот. Однако, как выяснилось, полного высыхания и не требуется: достаточно, чтобы в растворе не было «химически свободной» воды. В крепком рассоле (100 и более граммов NaCl на литр, как в Мертвом море) все молекулы воды прочно связаны с ионами натрия и хлора и не являются химически свободными. Поэтому в рассоле при температурах 60–80°C равновесие смещено в сторону образования связей, и аминокислоты соединяются в короткие цепочки (эта реакция называется «солевой пептидный синтез» и будет подробнее описана в следующих главах).”

Крепкий рассол бывает полезен не только для абиогеннного синтеза пептидов
7333482.jpg


На самом деле эта реакция не будет описана в этой книге подробно и тому есть причины. Именно поэтому подробнее ее рассмотрим мы. Но прежде, чем перейти к этому, я замечу, что запекание аминокислот при температурах выше 100°C отнюдь не приводит к их полному разложению, а дает совсем неплохой выход белковоподобного полимера – протеиноида. Было время, когда этот подход считался очень перспективным, а микросферы - надмолекулярные структуры, образуемые протеиноидами в растворе, народные энтузиасты-геккелисты считали живыми.** Однако у протеиноидов как предшественников белков слишком много проблем, и поэтому они давно вышли из моды. Но давайте посмотрим, что нового нам предлагает «солевой синтез», предложенный Rode и соавторами, о котором пишет автор книги.

Длительная инкубация аминокислот при очень высокой их концентрации в присутствии очень высокой же концентрации солей меди (работает в этой реакции катализатором) в крепком солевом растворе при температуре, близкой к температуре кипения, приводит к превращению нескольких процентов аминокислоты в дипептид (цепочку из двух аминокислот) и появлению трипептидов в следовых количествах. Стоит еще упомянуть, что образование пептидов в этой реакции идет только в очень сильно кислой среде (pH2); даже небольшое понижение кислотности (т.е увеличение pH до значения 3 и более) подавляет эту реакцию.

Вариантом «солевого синтеза» является также мягкая форма «запекания». В таких экспериментах раствор аминокислоты в крепком рассоле подвергают нагреванию до 85°C пока он не высохнет, а сухой осадок растворяют и снова упаривают при 85°C. В результате таких циклов высыхания и растворения образуется не только дипептид, но и измеряемое количество трипептида и следовые количества цепочек из четырех и пяти аминокислот. Заметим при этом, что типичный бактериальный белок это цепочка длиной около двух сотен аминокислот. Вот это и есть тот самый солевой синтез, о котором нам сообщают пОходя как о возможном решении проблемы абиогенного образования пептидов. В реальности мы имеем дело с процессом, протекающим в геохимически маловероятных условиях, который не приводит к образованию сколько-нибудь значительного количества пептида, не говоря уж о том, что пептиды длиной больше трех звеньев в этих условиях практически не образуются.

Понятно, что стиль научно-популярных книг изобилует неточными утверждениями. Но в книгах о происхождении жизни такие неточности играют большую и важную роль – они создают впечатление доказанности и в целом тривиальности некоторых утверждений, которые фактами не являются. Оброни в тексте такую «неточность» несколько раз, и вот уже появляется основа, на которой легче строить дальнейшие турусы на колесах аргументы.

Но вернемся к проблемам идеи первичного бульона, как их (совершенно справедливо) видит автор, который отмечает и вторую серьезную проблему – в первичном бульоне «нет границ». Синтезируемые протобелки и протонуклеиновые кислоты и прочие необходимые протоклетке молекулы разбавляются в мировом океане, в то время, как они должны накапливаться в одном месте, где между ними будут возникать разные полезные взаимодействия. Идея концентрации предбиологических молекул на минералах или в липидных пузырьках предлагается и для решения этой проблемы.

В качестве важного факта автор знакомит нас затем с подводными геотермальными источниками, т.н. «черными курильщиками» и «белыми курильщиками»***, выбрасывающими в океан перегретую глубинную воду, из которой при охлаждения выпадают сульфиды разных металлов, имеющие либо черный, либо белый цвет. Эти осадочные минералы образуются из очень маленьких частиц и пронизаны множеством пор. При этом нам сообщают два важных факта: (а) сульфидные минералы являются катализаторами многих химических реакций, (б) градиент температуры может концентрировать вещества в растворе, если они находятся внутри капилляра, а поры сульфидных минералов есть не что иное, как капилляры. Подробный рассказ о втором факте откладывается в этой главе «на потом». Но мы о нем не забудем, потому что это – еще одна шляпа, из которой нам обещают вытащить упитанного белого кролика.

А есть ли кролик вообще?
magician-top-hat-showing-trick-magic-performance-circus-show-concept-imaginary-rabbit-34771731.jpg


Несмотря на то, что автор представляет сульфиды в качестве вероятных предбиологических катализаторов, подводным геотермальным источникам в этой книге отказано в звании наиболее вероятного места возникновения жизни, каковым, по мнению многих, в том числе и автора книги, являются наземные геотермальные поля. Самый подходящим для этого типом наземных геотермальных источников признаются грязевые котлы (mudpot). Пар, поднимающийся от магматического очага через этот котел, по элементному составу напоминает цитоплазму клеток. Конденсация этого пара в присутствии минералов с огромной поверхностью, на которой находятся неорганические катализаторы, является по мнению автора книги прекрасной средой для абиогенного образования органики и возникновения макромолекул, а затем и жизни.

Булькающее содержимое грязевого котла
bubbling-mud.jpg


Глава 7 посвящена абиогенному синтезу нуклеотидов (кирпичиков нуклеиновых кислот) в ходе фотохимических реакций в атмосфере. Поскольку по мысли автора основным сырьем для этих реакций является метан, то прежде всего он описывает круговорот метана на древней Земле, который начинается на морском дне. Рассказ начинается с геотермальной структуры неподалеку от Срединно-Атлантического хребта под названием «Затерянный Город» (Lost City). Там из осадочных пород в форме колонн сочится горячая вода, разогреваемая на этот раз не магмой, а химическими реакциями в толще твердых донных пород. Растворенный в воде углекислый газ в этих реакциях восстанавливается до метана и муравьиной кислоты.

На древней Земле образовавшийся в геотермальных источниках метан выходил из океана в атмосферу и вступал под действием солнечных лучей в реакции с азотом, углекислым газом и водой, образуя целый ряд соединений, которые могут являться исходными веществами для абиогенного синтеза более сложных молекул, например, синильная кислота, цианамид и формальдегид. Эти молекулы выпадают на поверхность Земли с дождями и могут накапливаться при высыхании луж. Таким образом, с основным сырьем для получения нуклеотидов на древней Земле проблем, по мнению автора, не было.

Затерянный на дне Атлантики город...
Lost_City_(hydrothermal_field)02.jpg

... не имеющий никакого отношения к Атлантиде
320px-Lost_City_(hydrothermal_field)00.jpg


Далее речь заходит об их синтезе. Напомню, что нуклеотид состоит из азотистого основания (в ДНК их четыре вида, именно их названия образуют «буквы в тексте ДНК»), пятиуглеродного сахара (рибозы в РНК и дезоксирибозы в ДНК) и фосфата. Нуклеотид минус фосфат называется нуклеозидом. Автор честно признается, что с этим синтезом были проблемы. Давно известная реакция Бутлерова теоретически позволяет получить из формальдегида все сахара, но практически получается сложная смесь сахаров, да к тому же еще и сильно карамелизованная. Для выделения рибозы надо добавлять к смеси разные соли или минералы.

Азотистые основания тоже образуются, хотя сказать честно, не все там так радужно, как это выглядит в книге. Но не в этом дело, поскольку решить проблему образования нуклеозидной связи между основанием и рибозой в модельных предбиологических условиях так и не удалось. Поэтому автор, следуя текущей моде, представляет нам в качестве решения этой проблемы синтез нуклеотидов из простых соединений, в котором не требуется получать сначала основание и сахар, а затем соединять их. Это не преувеличение, работы Сазерленда и его группы ценятся сейчас необычайно высоко и считаются решительной демонстрацией возможности синтеза компонентов «мира РНК», о котором еще пойдет речь, в условиях ранней Земли.

Однако решением они являются только при существенном изменении подхода исследователей абиогенеза к стандартам доказательства. Сазерленд и коллеги предлагают в качестве такового пошаговые реакции, которые могут проходить в условиях, сходных с теми, которые могли существовать на ранней Землю, с участием простой органики. Цепочки таких реакций, соединяющие без разрывов исходные соединения и компоненты нуклеиновых кислот, и принимаются за решение проблемы. Как мы видим, здесь происходит полный отход от принципа исходных экспериментов в этой области, когда образование молекул, имеющих значение для возникновения клетки, ожидалось непосредственно в смеси исходных веществ.

Раньше и вода мокрее была, и абиогенные синтезы более весомые
SMiller


Является ли пошаговый подход в корне неверным? Так сказать нельзя, поскольку знания о потенциальных предбиологических реакциях он все же предоставляет. Но дать ответа на вопрос – могли ли эти реакции на самом деле происходить, приводя к ожидаемому продукту, он не может. Более того, в этом есть очень серьезные сомнения. Несмотря на то, что исходные продукты этого синтеза могли присутствовать на древней Земле, присутствие на ней лаборанта-химика крайне маловероятно, особенно по мнению энтузиастов геккелизма. А он, несомненно, требуется для такого синтеза. Например, синтез в работе, описанной в статье Powner, Gerland & Sutherland, 2009, начинается с реакции довольно простых органических соединений - гликольальдегида и цианамида - при 60°C в течение 3 часов. После этого к смеси добавляли глицеральдегид, понижали температуру до 40°C и инкубировали смесь еще 16 часов. При этом образуются промежуточные для этого синтеза соединения. Дальше цепочка доказательств идет так – возьмем чистые продукты этой реакции, растворим их и обработаем цианоацетиленом. В результате получаются исходные продукты для следующей стадии. Это вещества, в свою очередь, берутся в чистом виде и добавляются в следующую реакцию, и т.д.

Возможность, что такой синтез может происходить без участия химика, разумеется, никогда не была показана, потому что синтез этот требует добавления реагентов в определенное время, изменения условий реакции для оптимизации индивидуальных шагов, получения промежуточных продуктов в чистом виде и т.д. Более того, есть еще простая, но неразрешимая проблема концентраций реагентов. В этот синтез исходные простые органические вещества добавляются в очень высоких концентрациях. Насколько такие концентрации мыслимы в природных условиях авторы не обсуждают.

Чтобы сомнения в реалистичности моделирования в работах Сазерленда не показались вам пристрастными, приведу окончание статьи, которую я процитировал выше. «Наши результаты позволяют предположить, что условия ранней Земли могут рассматриваться предрасположенными к предбиологическому синтезу активированных пиримидиновых нуклеотидов. Хотя проблема необходимости раздельного добавления гликольальдегида и глицеральдегида остается нерешенной, события, при которых нагрев и высушивание могли сменяться охлаждением, растворением и ультрафиолетовым облучением, вполне могли происходить. Хотя сравнительный анализ таких моделей выходит за рамки этого исследования, мы надеемся, что описанная в нашей работе цепь реакций внесет свой вклад в этот анализ.»

Существует еще одна проблема с этим конкретным синтезом. В нем в качестве исходных веществ используются гликольальдегид и глицеральдегид, а их эффективное образование в предполагаемых условиях ранней Земли показано не было. Выше упоминалась реакция Бутлерова, которая теоретически позволяет получить из формальдегида разнообразные соединения углеводной природы, в том числе и эти альдегиды, но практически это совсем непросто. Поэтому группа Сазерленда предложила схему процесса абиогенного синтеза этих альдегидов, основанную на фотохимической реакции восстановления цианида с участием цианида меди как катализатора. В эту схему реакций вовлечен и формальдегид, а гликольальдегид и глицеральдегид являются одними из ее продуктов. Но и здесь они образуются одновременно и вместе находятся в довольно сложной смеси, так что проблему их раздельного добавления в реакцию синтеза нуклеотидов предложенный механизм не решает. Разумеется, не позволяет этот механизм и получить гликольальдегид и глицеральдегид в чистом виде, к тому же выход глицеральдегида в этой реакции совсем невелик - менее 5%.

Таким образом, все , что предложенные схемы позволяют сделать, это соединить исходные простые вещества с искомыми продуктами цепочкой написанных на бумаге формул химических реакций. Никаких доказательств того, что эта цепочка реакций может самопроизвольно протекать в природных условиях, приводя к образованию нуклеотидов со значительным выходом, в обсуждаемых выше работах не было предоставлено. Мы этого не знаем точно так же, как и до их публикации.

Заяц, извлекание которого из шляпы было анонсировано как загадочный трюк великого фокусника, оказался на поверку плюшевой игрушкой. Однако это не останавливает автора книги перед описанием появления нуклеотидов на ранней Земле. Не буду пересказывать в подробностях, это можно прочитать в книге Никитина, но подскажу, что вулканы с их способностью высушивать озера, а затем прокаливать их содержимое, как всегда, играют в этой схеме главную роль.

Лучшее из доступных мне изображений вулканов на ранней Земле 
rna-world-440


Стоит заметить, что во всех этих выкладках высокие концентрации синильной кислоты (цианистоводородной кислоты, цианистого водорода) на ранней Земле являются необходимым условием и не подвергаются сомнению. Однако, синильная кислота в воде быстро гидролизуется до формамида, особенно при высокой температуре. В нейтральной водной среде при 100°C половина синильной кислоты будет гидролизована за несколько часов. В этих условиях половина формамида будет гидролизована до муравьиной кислоты за несколько дней. По оценке С. Миллера (Miyakawa, Cleaves, & Miller, 2002) концентрация синильной кислоты и формамида (упоминаю о последнем, поскольку он участвует во многих предложенных схемах абиогенных реакций) в первичном океане были ничтожно малы. Миллер предложил потенциальной путь естественной концентрации синильной кислоты и формамида, который по мнению его группы заключается в вымораживании их из водных растворов. В общем, одно из двух должно сработать – или вымораживание, или выпаривание и прокаливание.

...или одно из двух. Ничего не понимаю!
Колобки.jpg


И в заключении первой части заметки вернусь к одному малозаметному карточному фокусу, который был нам показан автором книги по ходу рассказа. Речь шла о геотермальной структуре «Затерянный Город», где растворенный в воде углекислый газ восстанавливается до метана и муравьиной кислоты. Абсолютное большинство читателей пропустит как нечто тривиальное утверждение автора, которое следует за словами о метане и муравьиной кислоте. Цитата: «Если в воде был растворен углекислый газ, то он в этих условиях восстанавливается до метана (CH4) и муравьиной кислоты (HCOOH). В горячей воде Lost City растворено до 30 мг/л метана и водорода, до 7 мг/л муравьиной и до 1 мг/л уксусной кислоты; изотопный состав углерода в них точно такой же, как в углекислом газе, т. е. метан и кислоты образуются абиогенно, без участия микробов (Lang et al., 2010).” Эти слова создают впечатление очевидности того, что при подходящих условиях абиогенный синтез органических кислот идет с неотвратимостью.

Однако, если заглянуть в цитируемую статью, то оказывается, что (а) в книге приведены максимальные концентрации муравьиной и уксусной кислоты в полученных пробах, хотя во многих пробах они вообще не были обнаружены, (в) авторы статьи считают вероятным абиогенное происхождение только муравьиной кислоты, а уксусная кислота в воде Затерянного Города, по их мнению, имеет биологическое происхождение. Более того, поскольку некоторые энтузиасты считали чуть ли не всю органику Затерянного Города абиогенной, Lang и соавторы в последующей статье (Lang et al., 2013) проанализировали аминокислотный состав проб и пришли к выводу, что аминокислоты, действительно присутствующие в воде из Затерянного Города, являются биологическими продуктами.

Казалось бы, это всего лишь мелкая неточность или неполнота изложения, но эта неточность создает впечатление тривиальности факта абиогенного синтеза органических соединений. А мы заметим, что мы это заметили: даже простая молекула уксусной кислоты и та не синтезируется абиогенно в наивероятнейшем для подобных синтезов месте на современной Земле.

На этом месте я сделаю перерыв. Если резюмировать эту часть вкратце, то книга написана хорошо, автор старается рассматривать ключевые вопросы всесторонне и достаточно точно указывает на тупики и нерешенные проблемы. Однако написание научно-популярной книги по этой теме не позволяет избежать существенных преувеличений, значительных неточностей и логических искажений. Но в этом личной вины автора нет. Как говорилось в старом советском анекдоте: «Колебался. Но вместе с линией партии!» Так что и здесь все эти искажения и преувеличения являются не плодом творчества автора, а стандартом, принятым в этой особой области исследований.

Книга слишком длинна, чтобы рассказать о ней кратко. В следующем выпуске мы поговорим о «мире РНК» как он описан в книге Никитина.

* Просматривается интересная параллель с Мане и Моне. Надо подумать.
И еще одно замечание, сделанное «между прочим»; в 19 веке были и манеры, и монеры, а сейчас нет ни того, ни другого. Вот они – загадки природы и общества.

** Сам некогда читал это на каком-то афейском сайте, где публика ликовала о том, что наука изрядно посрамила мракобесов.

*** Как бы за проявление расизма не пришлось оправдываться.

В следующей, восьмой главе речь идет о происхождении хиральной чистоты молекул в предбиологических условиях. Если молекулы, имеющие стереоизомеры (идентичные структуры, которые выглядят, как зеркальные отражения или как две ладони у человека – вроде бы одинаковые, а перчатки почему-то разные, отчего и называют такую асимметрию хиральностью, от слова «хирос» - рука), играют роль в биологических процессах, все молекулы одного вида будут в этом отношении одинаковы – или левый стереоизомер, или правый. Но в абиогенных синтезах обычно получаются рацематы, т.е. смеси равных количеств двух изомеров.

Так выглядят оптические изомеры
765px-Chirality_with_hands.jpg


В главе описываются результаты наблюдений и экспериментов, которые позволяют предположить, что в некоторых реакциях иногда появляется некоторая степень асимметрии. Эту асимметрию можно усилить, если исходно вводить в реакцию оптический изомер. В общем, существуют намеки на пути возникновения хиральности, хотя мы, как и прежде знаем довольно мало.

Глава 9 рассказывает о начале мира РНК. Это, если честно, и является ключевой точкой рассказа о происхождении жизни (или одной из двух таких точек) в обсуждаемой книге, поскольку вторая ее половина, строго говоря, представляет собой рассказ о ранней эволюции жизни. Там речь пойдет и о минимальном наборе генов Луки (LUCA - Last Universal Common Ancestor, т.е. последний общий предок всех ныне существующих организмов), и о том, как разошлись эволюционные пути бактерий и архей, и т.п. Все это интересно, но все это происходит уже после возникновения жизни. Даже пресловутый ЛУКА и тот не является первым организмом на Земле, а является последним общим предком бактерий, архей и всего прочего.

А вот начало мира РНК относится к моменту гипотетического перехода абиогенеза в жизнь, поэтому мы на него внимательно посмотрим. Замечу только, что в этом журнале есть несколько постов о мире РНК (EinZweiDrei).

Итак, в предыдущих главах книги было найдено подходящее место для возникновения мира РНК, а именно грязевые котлы и возможно другие горячие источники на суше, где происходил синтез активированных нуклеотидов из веществ цианидно-формальдегидных дождей и выделяемых с вулканическими газами соединений фосфора.

Естественно, все начинается с того, что первые РНК появляются случайно. Процесс этот, говорят нам, очень прост; для него требуются только активированные нуклеотиды, которые могут быть нескольких видов, и минеральная поверхность. При наличии и того, и другого синтезируются цепочки РНК в пятьдесят, а то и во сто звеньев.

Еще лучше получаются длинные РНК при упаривании растворов нуклеотидов и липидов; в этом случае можно получить цепочки длиной свыше 100 звеньев. Автор рассказывает также о нескольких экспериментах, в которых получаются цепочки длиной от 2 до 6 звеньев, но мы даже не будем на них останавливаться, поскольку для мира РНК необходимы длинные РНК, какие-нибудь три- или тетрануклеотиды не катят достаточны.

Рассмотрим синтез на глине, обратившись к исходной статье (Huang & Ferris, 2006). Во-первых, слово «только» очень двусмысленно характеризует этот синтез. Да, не нужны другие вещества, но «только» может значить и «всего лишь», а как мы уже обсуждали выше, получение активированных нуклеотидов это совсем непростая задача. Можно считать, что она решена, посмотрев на цепочки уравнений реакции из работ Сазерленда (см. часть 1), но пока их в более или менее модельном предбиологическом реакторе никто не наработал. Тем более, что Хуанг и Феррис использовали совсем не тот вид активированных нуклеотидов, что получается на бумаге у Сазерленда, но тот, что лучше полимеризуется.

Концентрация исходного вещества была, как всегда, высокой, а выход, как всегда, низким. Авторы пишут, что для двух видов нуклеотидов (с основаниями аденин и урацил, будем использовать сокращения - А и У) получались цепочки до 40-50 звеньев. Для тех, что с гуанином (Г) возникли трудности в анализе, а для тех, что с цитозином (Ц) и для смесей нуклеотидов (более всего представляющих реальную РНК) максимальная длина цепочки была меньше. (Для Ц данные показаны и видно, что длина цепочек Ц значительно меньше, чем для А и У.) Более того, эти значения отражают максимальную длину, а большинство цепочек в продуктах этой реакции были гораздо короче. Похоже, что доля цепочек А и У длиной выше 30 звеньев не превышает 5%, а цепочек Ц такой длины просто не существует. Кстати, совсем непросто найти в тексте статьи ответы на вопросы количественного характера.

Есть и другая работа, о которой говорится в этой главе (Costanzo et al., 2009); в ней изучали полимеризацию нуклеотидов, которые сходны с теми, что должны получаться «по Сазерленду». Но уже здесь имеется расхождение между описанием и реальностью; в работах Сазерленда речь идет об образовании циклических фосфонуклеозидов, в которых фосфат находится между вторым и третьим углеродами рибозы, а в Costanzo et al., 2009 используются те, у которых фосфат находится между третьим и пятым углеродами рибозы. А это, как иногда говорят, две большие разницы.*

Полимеризация активированных нуклеотидов в работе Costanzo et al., 2009 дает довольно тривильные результаты; при нагревании до 85°С циклические (активированные) нуклеотиды образуют, в основном, цепочки длиной не более 15. В цепочках большей длины содержится на глаз не более 5% всего нуклеотидного материала, хотя следует заметить, что самые короткие цепочки не показаны; если бОльшая часть исходного материала находится в них, то доля материала в цепочках длинее 15 звеньев не 5%, а много ниже.

Любопытная сторона этих результатов заключаются в том, что короткие цепочки здесь соединялись друг с другом, значительно увеличивая свою длину, доходя до 100 звеньев, что разумеется, является желанным результатом с точки зрения геккелизма. Однако есть несколько обстоятельств, делающих эти результаты не слишком обнадеживающими: (а) выход длинных РНК-подобных полимеров был крайне мал, (б) только А и Г могли образовывать длинные цепочки, а цепочки Ц и У имели среднюю длину около 5-6 звеньев, (в) тот вид циклических нуклеотидов, который получается в пошаговом синтезе Сазерленда, не образовывал длинных полимеров, цепочки из него достигали максимальной длины всего в четыре звена.

В книге упомянут и еще один возможный путь абиогенного образования РНК, а именно нагревание АМФ (аденозинмонофосфат) в составе липидных пузырьков до 90°С. Смесь липида и АМФ при довольно высокой концентрации и того, и другого подвергается воздействию, приводящему к образованию липидных структур, внутри которых, похоже, и идет синтез. Смесь эта нагревается до температуры близкой к кипению, высушивается, снова обводняется, высушивается и т.д. Таким образом, имеет место многократное «запекание» нуклеотидов в условиях, когда они имеют дополнительную защиту от воды, находясь внутри липидных структур.

Анализ реакционной смеси в этом случае сам по себе представляет для нас интерес. Каким образом мы знаем, что в реакционной системе образуется цепочки аденозина? Сколько их образуется и какой они длины? На эти вопросы ответить не так просто; смесь достаточно сложная, образовавшуюся РНК для анализа надо тщательно отделять от липидов, а выход продукта невелик. Первый метод, использованный для обнаружения образовавшихся цепочек аденозина достаточно нетрадиционный и не отвечает прямо на количественные вопросы.

Второй метод основан на использовании флуоресцентного красителя, который начинает светиться, связываясь с РНК. Одна проблема этого метода в том, что многие примеси могут влиять на это свечение, а другая – в том, что он не говорит о длине цепочки. Согласно этим результатам в цепочки собирается от 1 до 6% исходного нуклеотида (от 2 до 3%, если смотреть на большинство показанных в статье проб).

Третий метод основан на введении в образовавшуюся РНК радиоактивной метки; он очень чувствительный, но в том виде, как он использован в этой работе, он ничего не сообщает нам об общем выходе цепочек. Более того, даже и эти результаты не вполне точно отображены в книге. Сами авторы статьи так описывают их: «Большинство РНК-подобных полимеров имели длину от 25 до 75 нуклеотидов с небольшой долей достигавшей области длины в 100 нуклеотидов». Действительно, при некоторых (но не при всех) из исследованных условий, цепочек длиной не менее 100 звеньев получается около 5% от всех полимеров (т.е. среди продуктов длиной выше 10 звеньев). Но мы не знаем, какова доля продуктов длиной выше 10 звеньев среди тех, что измеряются с помощью флуоресцентного красителя. Можно только быть уверенным в том, что она меньше того количества в 1-6%, о котором шла речь выше. Скорее всего, доля нуклеотидного материала, включенного в цепочки длиной 100 звеньев и больше, составляет в «хороших» пробах сотые доли процента от количества исходного нуклеотида.

Этот результат вполне соответствует результатам четвертого и пятого методов, использованных в работе. Эти методы – высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия - являются самыми стандартными и надежными и предоставляют больше всего информации. Они были использованы авторами, но не дали никаких результатов, которые можно было бы представить в статье, поэтому результаты описаны только текстом и только как предварительные, что само по себе необычно. При этом сказано, что ВЭЖХ позволила обнаружить малые количества цепочек длиной до 10 звеньев, а масс-спектрометрия показала присутствие цепочек длиной 20-30 звеньев. В общем и целом, длинные цепочки, если они и образуются в этой смеси, составляют очень малую долю исходного вещества; настолько малую, что их детекция представляет серьезную проблему.

Ну и что с того, что их мало? Зато на века! Не вполне. Не забудем, что независимо от пути образования молекулы РНК не очень стабильны в воде. В работе Costanzo et al., 2009 предлагается возможный, хотя и маловероятный способ стабилизации обрзовавшихся полимеров, заключающейся в добавлении к полученной цепочке исходного циклического нуклеотида в высокой концентрации; в этом случае длительность полужизни РНК в воде при 90°С возрастает с 36 часов до 8 суток. Поэтому РНК образуется не на века, а в лучшем случае на несколько недель, если речь идет о водном растворе.

Несмотря на все сказанное, у вас есть полное право возопить: «Это мелко, Хоботов!(с)» Нет, это совсем не мелко. Довольно короткий обсуждаемый фрагмент книги создает у читателя впечатление, что существует немало способов получить длинные (50, 100 и более звеньев) цепочки РНК-подобного полимера в условиях, реалистично моделирующих раннюю Землю.

Это мелко, Хоботов!
1053468778.jpg


Но реальность вовсе не такова. Было проведено несколько исследований по синтезу РНК-подобных полимеров. Условия этих экспериментов были, по большей части, не слишком реалистическими (в качестве исходных веществ использовали те, образование которых не было показано и/или маловероятно на ранней Земле, как всегда использовали высокие концентрации исходных веществ, образование использованных в этих работах липидных структур в геохимически-вероятных условиях не слишком вероятно), а продукты полимеризации были, в основном, гораздо короче 50 звеньев и их выход был чрезвычайно низок. Вопрос об образование 100-звенных РНК-подобных полимеров остается нерешенным.

Отчего нам важна длина этого продукта? Дело в том, что согласно идее мира РНК, которая и обсуждается в главе 9, критическим пунктом возникновения жизни является приобретения рибозимами (т.е. рибонуклеотидными энзимами, т.е. РНК-ферментами) способности к самовоспроизведению. Небольшое введение о мире РНК можно найти вот здесь.

Автор книги описывает состояние изучения роли рибозимов в происхождении жизни вполне хорошо. В качестве лучшего примера из известных нам рибозимов-полимераз, работающих в водном растворе при комнатной температуре, он приводит рибозим tC9 (Wochner et al., 2011). Этот рибозим способен осуществлять синтез последовательности РНК, комплементарной другой цепи РНК, который в этом синтезе является матрицей, т.е. делать то, что происходит в процессах репликации и транскрипции ДНК (репликация ДНК приводит к ее удвоению, а транскрипция к синтезу РНК, комплементарной последовательности гена, записанного в ДНК). В общем, такая реакция необходима для того, чтобы «мир РНК» существовал.

Вот такой синтез называется матричным. На картинке показан синтез информационной (она же матричная) РНК на ДНК-матрице (т.е. транскрипция). Показан еще синтез белка на РНК-матрице (т.е. трансляция; на нее пока можно не смотреть).
TransTranscrip


Как я уже сказал, о проблемах tC9 и подобных ему рибозимов, рассказано весьма откровенно. Во-первых, для синтеза требуется короткий фрагмент РНК, комплементарный матрице, т.е. образующий с ней участок двойной спирали. Рибозим (как и существующие ныне белковые ферменты реплицирующие ДНК) удлиняет эту затравку, добавляя новые звенья к растущему концу синтезируемой РНК. В цитируемой работе затравка была длиной 6 звеньев. По сравнению с другими эта проблемами невелика, поскольку абиогенный синтез коротких цепочек более вероятен, чем длинных. В любом случае, эта проблема не сложнее, чем обеспечение наличия в реакционной смеси активированных нуклеотидов, которые рибозим (и современные белки) и добавляет к растущей РНК.

Рибозимы-полимеразы; они удлинняет затравку, добавляя к растущей цепи по одному звену.
Screen shot 2014-07-03 at 12.13.44 PM

Screen shot 2014-07-03 at 12.14.54 PM


Во-вторых, не все РНК-матрицы могут быть использованы рибозимом, а только некоторые. Лучше всего копируются те РНК, которые не образуют устойчивых внутримолекулярных двуспиральных участков (т.н. шпилек). Но все рибозимы, включая и tC9, содержат много шпилек, поэтому себя они копировать не могут.

В-третьих, для самокопирования не хватает и скорости реакции. Максимальное удлинение растущей цепи РНК после 7 дней реакции в присутствии tC9 составляет 95 звеньев (вместе с затравкой получается 101). Причем выход самого длинного продукта всего 0,035% от количества затравки; т.е. только одна затравка из 3000 дорастает до максимальной длины. Это происходит по ряду причин, включая тривиальное расщепление рибозима, матрицы и/или продукта в воде; РНК достаточно чувствительны к гидролизу, поэтому синтез продукта должен проходит значительно быстрее, чем деградация участников реакции. Но tC9 имеет длину около 200 нуклеотидов, поэтому образование 100-звенного продукта не было бы достаточно для самокопирования этого рибозима даже если бы он сам был подходящей матрицей (см. «во-вторых”).

В-четвертых, рибозимы-полимеразы имеют недостаточную точность, они нередко ошибаются и добавляют к растущей цепи нуклеотид, который не комплементарен соответствующему звену матрицы, в результате чего продукт не будет копией матрицы. Для действительного самокопирования число ошибок должно быть меньше одной на копию – такое условие называется пределом Эйгена. Вероятность того, что tC9 сделает ошибки при удлиннении цепочки на один нуклеотид равна 2,7%, т.е. очень высока. В цитируемой работе авторы получили путем отбора вариант этого рибозима, который делал меньше ошибок, но и для него вероятность ошибки была высока – 0,9%. Т.е. вероятность того, что он сможет добавить 100 звеньев без единой ошибки менее 60%. Таким образом, если этот вариант рибозима, как и его предшественник tC9, может нарастить до длины в 100 звеньев одну затравку из 3000, половина этих продуктов не будет точным отображением матрицы.

И наконец, в-пятых - после работы рибозима-полимеразы образуется длинная двунитевая РНК, которая не может служить матрицей для следующего копирования, если комплементарные цепи не разойдутся. В клетке это обеспечивается работой специализированных белков, а в абиогенных условиях этого можно достичнуть кратковременным нагреванием до температуры, близкой к кипению. В принципе, перепады температуры могли бы создать условия для такой реакции, но здесь очень много своих сложностей; можно начать хотя бы с того, что гидролиз РНК при таких температурах идет еще быстрее, чем при комнатной.

Теоретически существует и другой способ самокопирования, основанный на сшивании фрагментов РНК, комплементарных последовательнсти рибозима, в ходе лигазной реакции, катализируемой этим рибозимом. Рибозимы-лигазы обычно короче рибозимов-полимераз, что делает их возникновение более вероятным. Но для самокопирования они нуждаются в наличии довольно длинных фрагментов РНК, которые они будут “сшивать” для построения из них собственных копий. В примере, который я приводил в давнишнем посте, рибозим-лигаза длиной около 60 звеньев сшивал цепочки длиной приблизительно 50 и 10 звеньев, а они должны откуда-то браться.

Результат работы рибозимов-лигаз; происходит сшивание существующих цепочек.
Screen shot 2014-07-07 at 1.07.41 PM


В общем, известные ныне рибозимы не могут самовоспроизводиться, и это вполне признается в книге. В качестве возможной альтернативы упоминается матричный синтез вовсе без участия ферментов – и белковых, и рибозимов. Неферментативный абиогенный синтез РНК-подобных полимеров из активированных нуклеотидов может, в теории, происходить на одноцепочечной РНК-матрице. Но по сравнению с рибозимами, преимуществ подобный синтез не дает: скорость его еще меньше, ошибок при нем еще больше, образовавшуюся двойную спираль для последующих синтезов надо разделять на цепочки. Речь тут обычно идет о полимеризации активированных нуклеотидов, поскольку иначе они в цепочки не собираются. Так что и этот синтез не решает проблем.

В рассказе об абиогенных синтезах речь неоднократно заходила о концентрации исходных веществ; они должны быть значительно выше тех, что бывают получены в модельных синтезах, и различных оценок своей стационарной концентрации, которая может быть достигнута в первичном океане. Поэтому идея концентрации веществ, необходимых для абиогенных реакций, в условиях ранней Земли постоянно обсуждалась. О новом варианте этой идеи, обсуждаемом в контексте синтеза РНК-подобных полимеров, рассказано в книге.

«Для геотермальных полей характерны мелкопористые осадки и устойчивая разница температуры между горячей подземной водой и холодным воздухом. В этих условиях в порах и трещинах, заполненных водой, возникает устойчивая конвекция...”, - говорится в книге.

Далее идет речь о работах, в которых изучалось поведение нуклеотидов и РНК разной длины в поре, закрытой снизу и открытой сверху. Цитата: “При подогреве сбоку в такой поре происходит конвекция жидкости и перенос растворенных молекул вдоль градиента температуры (термофорез). Нуклеотиды и РНК в такой поре подсасываются из холодной воды и эффективно накапливаются в нижней части холодной стенки [см. рисунок из книги - Партизан]. Для поры шириной 1 мм и длиной 10 мм получается концентрирование нуклеотидов и коротких РНК в шесть-семь раз. Но степень концентрирования очень сильно … зависит от отношения длины к ширине поры. Пора размером 0,1 мм × 10 мм или 1 мм × 100 мм концентрирует нуклеотиды примерно в 100 млн раз. РНК длиной примерно 40 нуклеотидов и более ведут себя по-другому по сравнению с одиночными нуклеотидами и короткими РНК. Они очень сильно концентрируются даже в коротких порах – в 20 000 раз в поре 1 мм × 10 мм для РНК длиной 100 нуклеотидов. Длинные молекулы РНК, попавшие в такую пору, практически неизбежно захватываются ею и накапливаются на маленьком (меньше 0,01 кв. мм) участке в нижней части холодной стенки. Концентрация РНК там ограничена только их физическими размерами.”

Вот так происходит концентрация растворенных веществ в порах.
Pores.jpg


Действительно, термофорез существует, и действительно, в подобной системе будет происходить концентрирование любых молекул в зависимости от их размера и заряда, а также других параметров. Отношение концентраций на дне такой поры и в растворе, из которого подсасывается вещество, экспоненциально зависит от некоего коэффициента, характеризующего молекулу в растворе, градиента температуры поперек поры и отношения длины поры к ее диаметру. Коэффициент, характеризующий молекулу в растворе, в свою очередь, зависит от концентрации соли, повышение которой ослабляет концентрирование. Огромные концентрации в глубине поры зависят от благоприятного сочетания всех факторов. В работе, которая приводится в этом месте книги (Baaske et al. 2007), расчеты производятся при допущении градиента в 30 градусов на толщину поры. Оптимальная толщина поры для концентрации нуклеотидов составляет чуть меньше 0,15мм, т.е. градиент составляет около 200 градусов на 1 мм, что довольно нереалистично. Более реалистичные значения градиентов будут снижать степень концентрирования.

Кроме того, в «идеальной поре» не происходит потерь вещества через ее стенки, которые не могут быть непроницаемыми, и оно не уносится с восходящим током воды. Были проведены расчеты с учетом подобных потерь, но они затруднены отсутствием данных, например, о скорости потока жидкости в этой системе. В дополнение замечу, что на концентрирование может влиять и связывание переносимых веществ с минеральной поверхностью пор, но в этих работах этот фактор не рассматривается.

Казалось бы – если эта система так хороша, то вот вода, вот поры, вот активированные нуклеотиды – что мешает провести модельный эксперимент? М. Никитин пишет: «В работе Маста с коллегами (Mast et al., 2013) было рассчитано, что в тепловой ловушке будут получаться РНК длиной 200–300 нуклеотидов безо всяких ферментов и рибозимов. К сожалению, по техническим причинам проверяли они эти расчеты не на полимеризации РНК из отдельных нуклеотидов, а на ДНК, и при этом еще не сборка отдельных нуклеотидов, а стыковка 95-нуклеотидных фрагментов ДНК при помощи одноцепочечных «липких концов».”

И вот уже появляется абиогенная РНК длиной 200–300 нуклеотидных звеньев, что вполне достигает длины рибозима. Но не упустим того факта, что все это является результатом расчетов при допущении того, что соотношение скоростей соединения нуклеотидов в цепочки РНК-подобного полимера и распада этого полимера равно отношению скоростей соединения двух цепочек ДНК с “липкими концами” и разъединениям этих цепей. Это допущение звучит очень странно. С некоторой долей смущения, я вынужден повторить за незабвенными Колобками: “Ниччиво не понимаю!”

Колобков вы должны помнить, мне кажется.
Колобки.jpg


«Липкие концы» двух ДНК это одноцепочечные участки этих ДНК, комплементарные друг другу. При их контакте образуется двойная спираль и исходные ДНК оказываются нековалентно (т.е. без образования химической связи), но довольно прочно присоединенными друг к другу. Чем длиннее соединившиеся липкие концы, тем прочнее такое соединение; при длине в 25 нуклеотидов, как это было в работе Маста и коллег, для разрушения образовавшегося соединения требуется нагреть раствор приблизительно до 70-80°С или выше. В эксперименте температура не превышала 60°С, т.е. соединение было достаточно прочным.

Липкие концы. Нарисованные на картинке будут держаться друг за дружку до температуры около 8°С.
sticky ends.jpg

Скорость роста цепочек нуклеотидов, о которой шла речь в рассказе об абиогенном синтезе РНК-подобных соединений, зависит от того, как быстро присоединяется следующий нуклеотид к предыдущему, образуя прочную ковалентную связь. В свою очередь, скорость расщепления цепочек зависит от скорости реакции гидролиза связи между нуклеотидными звеньями. В статье же Маста и соавторов измеряются скорости, с которыми соединяются и распадаются липкие концы двух ДНК, потому что реакцию авторы измеряли по интенсивности оптического сигнала, зависящего от физического контакта этих липких концов. Эквивлентность скоростей этих процессов ниоткуда не следует.

Таким образом, получается так же, как и всегда. Теоретические работы показывают, что при определенных условиях, реализм которых вызывает сомнения, (а) вещества могут концентрироваться в капиллярах с приложенным к ним поперечным градиентом температуры и (б) благодаря разницам свойств малых молекул и их полимеров, полимеры могут избирательно накапливаться на дне капилляров. (Я не особенно заострял внимание на (б), но при определенных условиях расчеты приводят к таким результатам.) Эти расчетные результаты так и не были проверены в модельном эксперименте, хотя статья Baaske et al., которую можно считать исходной в этой серии работ, была опубликована в 2007 году. Или все же были и результат оказался не заслуживающим публикации? Так или иначе, расчеты в этих моделях приводятся в качестве решения проблемы синтеза полимеров нуклеотидов, хотя их очень трудно считать таковым.

На этом месте я сделаю перерыв в рассказе о своих впечатлениях о новой книге - все же жизнь не сводится целиком к этому увлекательному занятию. Еще раз повторю, что у обсуждаемой книги есть действительные и несомненные достоинства. Во-первых, о работах в области исследований путей самопроизвольного возникновения жизни рассказывается подробно и в оборот популярной литературы вводится много новых сведений. Во-вторых, проблемы в этой области перечисляются довольно обстоятельно и, по большей части, не затушевываются.

И тем не менее, в книге не может не быть обычных для этой области исследований недостатков. Соответствие результатов гипотезе не всегда возможно оценить, поскольку гипотезы обычно изложены не очень конкретно; остается непонятно, насколько результаты ей соответствуют, отчего в памяти читателя остается только расплывчато сформулированная гипотеза, а не факт расхождения между ней и результатами.

Нерешенную проблему (т.е. такую, которая была подробно исследована и результаты противоречат гипотезе) часто оставляют в таком состоянии, когда результаты звучат не полностью пессимистично, так что читатель остается с ощущением, что «в основном науке все ясно, хотя некоторые детали остались все еще не до конца выясненными». Этому помогает то, что результаты нередко упоминаются в благополучном ключе, но не слишком подробно, так что читатель остается в неведении касательно детялей, а когда и это не помогает, то результаты изящным образом искажаются.

Именно поэтому я обратил ваше внимание на описание абиогенных синтезов РНК-подобных молекул в этой главе. Если пробежать ее по диагонали, то кажется, что РНК-цепочки в 50 и 100 звеньев возникают без особых проблем, а в порах минералов горячих источников это получается еще лучше. Однако ни первое, ни второе утверждение не является верным.

Более того, рассказ о концентрировании и синтезе полимеров в порах дан после рассказа о проблемах рибозимов. А запоминается, как замечал приснопамятный Штирлиц, последняя фраза. Ну уж если совсем-совсем честно, то последней фразой является главка о решении проблемы затравок. Я не стал о ней писать, поскольку не уделял здесь проблеме затравок большого внимания. Тем более, что решением проблемы в данном случае является умозрительное соображение, а не синтезы в нашей любимой колбе.

Штирлиц тоже любил побаловаться со стеклянными емкостями для жЫдкостей.
842332_640.jpg


Из такой колбы однажды выползет зеленый змий  хаммункулюс  новая светлая жЫзнь.
miller_urey


Продолжение непременно последует. Обещаю, что в следующих частях я постараюсь поменьше мучить вас пересказом результатов и думаю, что у меня это получится. Во-первых, потому, что проблему расхождения результатов научных работ и их описания мы достаточно обсудили на примере девятой главы, а во-вторых, потому, что по мере углубления в книгу мы будем реже встречать результаты, которые можно будет обсуждать достаточно конкретно. 

* Вот вы скажете "какая разница?" А такая - от понедельника до четверга - три дня, а от четверга до понедельника - четыре.

Источник: https://partizan-1812.livejournal.com/218159.html,https://partizan-1812.livejournal.com/219283.html


Добавить комментарий


Защитный код
Обновить